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内源性孤啡肽通过对缝隙连接蛋白43的调节
杨光 熊畅 韩毅 杨建新
山西医科大学麻醉学系，太原；2医院麻醉科，太原
国际麻醉学与复苏杂志,,40(01):47-52
DOI：10./cma.j.issn.-..01.
基金项目
国家自然科学基金青年科学基金（）；
山西省应用基础研究基金青年基金（D）；
山西医科大学创新创业校级项目（）
ORIGINALARTICLES
急性心肌梗死后约50%的患者会发生心源性猝死，而恶性室性心律失常是心源性猝死的重要原因之一。在缺血性心律失常的发病机制中，缝隙连接的结构和功能变化引起的电脱耦联是非常重要的因素。缝隙连接通道主要由缝隙连接蛋白43（Cx43）构成，作为一种磷酸化蛋白，其含量、分布尤其是自身磷酸化状态的改变与各种心律失常的产生和持续密切相关。有研究表明，在急性缺血性的心肌组织中，随着缺血的加重，心肌内磷酸化Cx43（p-Cx43）水平下降，而去磷酸化的Cx43水平升高，使细胞间脱电耦联，导致传导异常而出现心律失常。本课题组前期研究发现，在大鼠急性心肌缺血模型中，孤啡肽（OFQ）在脊髓和背根神经节表达上调，提示在急性心肌缺血病理过程中可能有OFQ参与。OFQ受体属于G蛋白耦联受体，是神经肽的一份子，研究表明，OFQ除参与外周和中枢神经对心血管的调节之外，还可能直接参与对心血管系统的调节。目前，内源性OFQ是否通过对Cx43蛋白的调节影响机体在急性心肌缺血时心律失常的发生以及三者之间的关系尚不明确。本研究旨在探索内源性OFQ是否通过调节Cx43从而影响机体在急性心肌缺血时心律失常的发生。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
ProteaseandPhosphataseInhibitorCocktail、Anti-Connexin43/GJA1（phosphoS）抗体、Anti-Connexin43/GJA1抗体、UFP-/乌拉坦、动物呼吸机（型号：ALC-V8，上海澳尔科特生物科技有限公司）、电生理信号记录仪。
1.2 实验动物及分组
同龄健康成年清洁级雄性SD大鼠64只，体重~g，由山西医科大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为对照组（C组，24只，分为3个亚组，即冠状动脉结扎后15min亚组、冠状动脉结扎后60min亚组、冠状动脉结扎后min亚组，每个亚组8只）、OFQ受体拮抗剂组（U组，24只，分为3个亚组，即冠状动脉结扎后15min亚组、冠状动脉结扎后60min亚组、冠状动脉结扎后min亚组，每组8只）、假手术组（S组，16只，分为两个亚组，即冠状动脉只穿线不结扎15min亚组、冠状动脉只穿线不结扎60min亚组，每个亚组8只）。
1.3 动物模型制备及给药方法
乌拉坦（25%，1.2g/kg）腹腔注射麻醉，尾静脉置入24G套管针以方便给药，连接ECG。气管切开置管，动物呼吸机设定潮气量8ml/kg、呼吸频率70次/min，行机械通气。U组按大鼠体重1μl/g尾静脉给予OFQ受体拮抗剂UFP-（10-9mol/L）。C组给予等容积的生理盐水。给药后于胸骨左侧胸壁第5肋间切皮，逐层钝性分离至心脏，撕开心包，在肺动脉圆锥与左心耳之间用5-0无损伤缝线在冠状动脉左前降支起点下2mm结扎。S组在冠状动脉下只穿线，不结扎。在胸腔置入引流管后关胸，将胸腔抽成负压。判断模型是否成功标志：①结扎后，ECG表现高大T波以及ST段倾斜抬高与高耸T波融合及QRS波群振幅增高（图1）；②结扎后相应血管支配区心肌颜色变白。
1.4 检测指标及方法
具体处理如下：分别记录C组、U组大鼠从给药前10min到冠状动脉结扎后15、60、min的ECG数据。待各组结扎够相应时间后迅速开胸，嘱一名助手在大鼠头侧采用断头法处死大鼠，同时实验者在左心室长轴留取0.5cm3大小的左心室游离壁心肌组织放入液氮中速冻，置于－80℃冰箱冻存，用于Westernblot分析。
1.4.1 ECG数据分析
分析各组大鼠室性期前收缩（单发室性期前收缩）发生次数、联律（二联律+三联律）发生次数，室性心动过速和心室纤颤（室颤）的发生率、发生次数、持续时间。
1.4.2 Westernblot分析
将冻存的组织块液氮下研磨后匀浆，裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，配置凝胶，每孔上样20μl，依次进行电泳，0.45μmPVDF膜转膜，3%胎牛血清封闭1h，1∶稀释p-Cx43多克隆抗体，4℃过夜，TBST洗10min×3次，酶标记抗体二抗（1∶0）室温孵育2h，TBST洗10min×3次，用ECL显色，X线片曝光显影，凝胶成像分析系统摄像分析；洗脱抗体后用上述相同方法测定总Cx43水平，用p-Cx43与总Cx43灰度值的比值作为p-Cx43的相对表达水平。
2 结 果
2.1 ECG统计结果
冠状动脉结扎后15min时，与C组比较，U组室性期前收缩发生次数、联律的发生次数以及室性心动过速和室颤的持续时间明显下降（P＜0.05）。冠状动脉结扎后60min时，与C组比较，U组室性期前收缩发生次数、联律的发生次数以及室性心动过速和室颤的发生次数明显下降（P＜0.05）。冠状动脉结扎后min时，与C组比较，U组室性期前收缩发生次数、联律的发生次数以及室性心动过速和室颤的发生次数明显下降（P＜0.05，表1）。
2.2 Westernblot结果
各组大鼠15min亚组的结果如下：与S组比较，C组p-Cx43表达明显减少（P＜0.05）；与C组比较，U组p-Cx43表达明显增加（P＜0.05）；与S组比较，U组p-Cx43表达无明显变化（P＞0.05，表2、图2）。
各组大鼠60min亚组的结果如下：与S组比较，C组、U组p-Cx43表达均减少（P＜0.05）；与C组比较，U组p-Cx43表达无明显变化（P＞0.05，表3、图3）。
3 讨 论
研究发现，OFQ受体能够通过外周及中枢途径识别节前或节后的交感和副交感神经纤维，支配血管和心脏，参与OFQ的心血管效应，并可能在原发性高血压、心肌缺血及脑缺血的病理生理学中发挥一定作用。最近研究发现，大鼠急性心肌缺血时其脊髓和背根神经节OFQ表达上调，再次说明了急性心肌缺血病理过程中有OFQ参与。
本研究发现，以室性期前收缩和联律的发生次数来看，C组冠状动脉结扎后15min亚组室性期前收缩和联律的均数分别占到C组冠状动脉结扎后60min亚组和C组冠状动脉结扎后min亚组的90%及70%以上，提示我们大鼠的心律失常大部分发生在冠状动脉结扎后15min内，而在冠状动脉结扎后15~60min、60~min内鲜有发生。这与Opitz等的研究观点基本一致。本研究还发现，与C组比较，使用OFQ受体拮抗剂UFP-可以明显减少急性心肌缺血后室性心律失常的发生，提示内源性OFQ有增加急性心肌缺血时室性心律失常发生的可能。
研究表明，在心肌缺血开始的10min主要由中枢交感神经兴奋引起过量儿茶酚胺释放，而当心肌缺血10min后，外周局部儿茶酚胺释放将逐渐占据优势，这个过程与中枢交感神经调节是相互独立的。而在急性心肌缺血时，我们可以观察到心脏局部去甲肾上腺素浓度升高及心肌细胞对儿茶酚胺的敏感度增高。而急性心肌缺血引起的儿茶酚胺释放正是细胞损伤以及心律失常的关键诱因。此外，研究表明，强烈的交感神经刺激会引起神经肽-Y的释放，它能作用于胆碱能神经的Y2受体，减少乙酰胆碱的释放，进而增加心律失常的易感性。前已述及，OFQ也是神经肽的一种。所以我们推断内源性OFQ通过交感神经通路促进急性心肌缺血时心律失常的发生。
目前已经明确，心室肌细胞间电耦联通道结构中最重要、最关键的组分是由连接蛋白所构成的Cx43，作为一种磷酸化蛋白，其磷酸化状态决定着自身的活性和连接通道的开关。大部分心肌细胞Cx43在基础状态下处在磷酸化状态，但在某些病理生理状态下尤其是心肌缺血时可导致Cx43快速去磷酸化从而致使心肌电冲动脱耦联。研究发现，在心肌缺血诱发电耦联障碍的同时，还伴有Cx43去磷酸化，并且心肌细胞电耦联障碍程度同Cx43去磷酸化呈正相关。在大鼠心肌缺血模型的研究中也证实缺血会引起Cx43去磷酸化，也就是磷酸化Cx43含量下降，而Cx43磷酸化与去磷酸化比率的失调增加了室性心律失常的发生。综上所述，缺血诱发的Cx43去磷酸化会导致心室细胞之间电脱耦联，进而引起各种心律失常。
根据之前心律失常的实验结果得出大鼠冠脉结扎后心律失常大部分发生在冠状动脉结扎后15min内，而在冠状动脉结扎后15~60min、60~min内鲜有发生，所以我们在接下来的实验中选取冠脉结扎15、60min这两个时间点进行研究。本研究发现，各组大鼠15min亚组中，C组p-Cx43表达较S组减少，而U组p-Cx43表达较C组增加，说明急性缺血15min时，心肌p-Cx43表达明显减少，而使用OFQ受体拮抗剂UFP-后，心肌p-Cx43表达明显增加，甚至超过S组。各组大鼠60min亚组中，C组p-Cx43表达较S组减少，表明急性心肌缺血后60min时p-Cx43表达仍旧减少，但U组p-Cx43表达却也低于S组。
我们推测心肌缺血60min时，随着机体对刺激强度的适应，以及应用内源性OFQ受体拮抗剂UFP-和机体可能通过其他通路等调节p-Cx43表达，使得U组p-Cx43表达较C组增加，但较S组减少。上述蛋白表达与心律失常结果的趋势是一致的。前已述及，p-Cx43表达的减少易引起室性心律失常，而使用OFQ受体拮抗剂UFP-后心律失常显著减少，同时伴随p-Cx43表达增加，所以我们推测内源性OFQ可通过Cx43去磷酸化增加心肌缺血后心律失常的发生，其可能机制为OFQ对Cx43Ｃ末端某些磷酸化氨基酸位点有识别作用。
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