益气复脉改善小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用

郑显杰，庞力智，韩玉潇，李芳，寇俊萍，余伯阳*

(中国药科大学，江苏省中药评价与转化重点实验室)

缺血性心脏病(ischemicheartdisease，IHD)是因冠脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，易致心肌梗死或心衰，故死亡率甚高，严重威胁人类生命健康和生活质量，造成医疗消耗和医疗负担日益沉重。目前溶栓治疗和直接经皮冠状动脉介入治疗(PCI)成为防治心肌缺血性疾病最有效的手段，然而在心肌缺血恢复血流过程中易引起心肌再灌注损伤(myocardialischemia/reperfusioninjury，MIRI)，可进一步导致心肌细胞的死亡和梗死面积的增加，干预心肌缺血再灌注，可减小40%～50%的梗死面积，有利于减轻心肌损害。

注射用益气复脉(冻干)(YQFM)是基于中药经典方剂生脉散研制而成的一种现代注射制剂，由红参、麦冬、五味子组成，具有益气复脉，养阴生津之功效，临床用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚症和冠心病所致慢性左心功能不全Ⅱ、Ⅲ级气阴两虚证，疗效确切，副作用较低。药理学研究证实，该制剂可显著改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌损伤及冠脉结扎诱导的大鼠慢性心衰，但有关其对小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用，尚未见报道。本研究拟重点探讨注射用益气复脉(冻干)改善小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用以及时效关系，为其防治心肌缺血再灌注损伤的临床合理用药提供实验依据。

1材料

1.1试剂与仪器水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；红四氮唑(TTC)(上海灵锦精细化工有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)测试盒(南京建成生物工程研究所)；DW-型小动物人工呼吸机(北京众实迪创科技发展有限公司)；电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BL-S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；VisualSonicsVevo小动物专用高频彩色超声(加拿大Vivosonic公司)；奥林帕斯DX45显微镜(日本Olympus公司)；DP72相机(日本Olympus公司)；6-0带线缝合针(上海浦东金环医疗用品股份有限公司)。

1.2药物与制剂注射用益气复脉(冻干)(天津天士力之骄药业有限公司，批号)；盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰制药有限公司，批号)；氯化钠注射液(晨欣制药有限公司，批号)。

1.3实验动物雄性ICR小鼠，8周龄，体质量(25±2)g，SPF级，由扬州大学比较医学动物中心提供，动物合格证号为SCXK(苏)-。

2方法

2.1动物分组与给药取雄性ICR小鼠只，随机分为假手术组、模型组、缺血前10min给予益气复脉组(益气复脉+10min)、缺血后0min给予益气复脉组(益气复脉－0min)、缺血后10min给予益气复脉组(益气复脉－10min)、缺血后20min给予益气复脉组(益气复脉－20min)、缺血后30min给予益气复脉(益气复脉－30min)、阳性药组(Verapamil)8组，每组13只。益气复脉给予剂量为1.g/kg(相当于生药量4.51g/kg)，Verapamil为1.85mg/kg(术后20min给药)，各制剂以氯化钠注射液溶解。各组小鼠腹腔注射给药1次，假手术组和模型组分别给予等量的氯化钠注射液。手术过程中因技术原因造成小鼠意外死亡，各组间数量不均。后以相同模型制备方法，制备模型3次，供数据测定。

2.2小鼠心肌缺血再灌注模型的制备采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定，胸部剪毛，碘酒-酒精进行皮肤消毒，连接人工呼吸机(潮气量3mL，呼吸比2∶1，心率次/min)。参考文献，在胸骨左侧与胸骨平行作一纵行切口(1.2cm)，钝性分离胸大肌，暴露第四根肋骨，从第四根肋骨处用止血钳打开胸腔，撕开心包，暴露心脏，轻压胸廓即可将心脏挤出胸腔外。用6-0号丝线，在冠状动脉左前降支起源出下方3mm处连同线穿过的心肌一并结扎(活结)，结扎完成迅速放回胸腔，留线头在胸腔外以便再灌，挤出气体并缝合。30min后，轻拉留在外的线头，解开活结，恢复心脏冠脉血流，发生再灌注。24h后，测定各项指标。模型制作期间用BL-S生物机能实验系统对心电图进行实时监控。

2.3小动物高频彩色超声(US)测定再灌注24h后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰位，利用VisualSonicsVevo小动物专用高频彩色超声仪，测定各组小鼠心脏射血分数(EF)和缩短分数(FS)。

2.4血清酶活性测定再灌注24后，小鼠眼眶取血，室温静置30min后，r/min离心10min，取上清，冷冻保存。采用试剂盒测定肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)活力，方法参照试剂盒说明书。

2.5心脏病理组织形态学变化观察取血后摘取心脏，取左心室结扎位置到心尖的病变区域，经10%福尔马林固定2d，常规石蜡包埋，切片(5μm厚)，二甲苯脱蜡10min，再用%乙醇置换二甲苯2min，95%乙醇置换1min，80%乙醇置换1min，75%乙醇置换1min，蒸馏水冲洗2min，苏木精染色5min，流水洗去苏木精液，盐酸乙醇分化30s，水浸泡15min，伊红染色2min，常规脱水，透明，中性树胶封片，采用光学显微镜观察其组织病理学改变(摄片倍数×，标尺长50μm)。心肌细胞变性、坏死等按病变占被检心脏的范围分别标记为0.5分(轻微)、1分(轻度)、2分(中度)、3分(重度)、4分(极重度)。累加所有分数，并计算出每组动物的均分。

2.6心脏梗死面积的测定另摘取心脏，置于－20℃冰箱冷冻2h，取出后从结扎处到心尖，切1～2mm左右的薄片，连续5片。将切片置于含1%TTC(pH7.4)染液培养皿，避光37℃孵育15min，取出拍照记录。应用图像分析系统ImageJ测量心肌梗死面积，即梗死心肌占左心室面积百分比(IR/LV)。

2.7统计学分析所有数据采用GraphpadPrism5软件进行统计，实验数据以`c±s表示，对各组数据比较采用方差分析，对于两组间的比较采用Student’s检验，当3组或3组以上比较时采用Dunnett’s检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1不同时间点给予益气复脉对心肌缺血再灌注损伤模型小鼠心脏功能的影响采用小动物专用高频彩色超声仪，测定各组小鼠心脏射血分数和缩短分数。如图1所示，模型组小鼠心脏射血分数和缩短分数明显降低，与假手术组比较，具有极显著差异(P＜0.01)；各时间点给药组与模型组比较，心脏功能都有一定程度改善，但无显著性差异(P＞0.05)。

3.2不同时间点给予益气复脉对心肌缺血再灌注损伤模型小鼠心脏梗死面积的影响对心脏切片进行TTC染色，测定各组梗死面积。如图2所示，模型组心肌梗死面积显著增加，与假手术组比较，具有显著性差异(P＜0.01)；各时间点给药组梗死面积均明显下降，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。益气复脉各组与阳性药Verapamil组之间无显著性差异(P＞0.05)，表明不同时间点给予益气复脉都可有效降低缺血再灌注心肌梗死面积，且缺血后给药略优于缺血前10min给药。

3.3不同时间点给予益气复脉对心肌缺血再灌注损伤模型小鼠心脏病理组织形态学变化的影响利用HE染色对各组心脏损伤程度进行评估，如图3所示，模型组小鼠心内膜下心肌坏死，血管周围出现水肿现象，嗜中性粒细胞浸润严重，病理组织学评分与假手术组比较，具有显著性差异(P＜0.01)；益气复脉－0min、益气复脉－10min、益气复脉－20min、益气复脉－30min与模型组比较，心肌病理组织学形态均有显著性改善(P＜0.01)；益气复脉+10min组与模型组比较，有一定改善趋势，但评分无显著性差异(P＞0.05)，并比益气复脉－30min组损伤严重(P＜0.05)。

3.4不同时间点给予益气复脉对心肌缺血再灌注损伤模型小鼠血清CK及LDH活性的影响对各组小鼠血清进行CK及LDH活性测定，如图4所示，模型组CK及LDH活性显著升高(P＜0.01)，而不同时间点给药益气复脉后，与模型组相比，CK及LDH活力均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。此外，各给药组均能显著降低CK活力，但各组别之间无显著性差异(P＞0.05)，提示阳性药Verapamil与益气复脉在不同给药时间点对心脏再灌注损伤都具有一定保护作用，而益气复脉－20min、益气复脉－30min，降低LDH活性作用明显优于益气复脉+10min、益气复脉－0min、益气复脉－10min3个给药时间点(P＜0.01)。

4讨论

我国成年人理想心血管健康比例极低，约为0.2%，冠心病死亡率有逐步增大的趋势。尽快恢复冠脉血流是临床上治疗心肌缺血的重要手段，然而再灌注过程中往往对心肌产生不可逆转的损伤。心肌缺血再灌注损伤是多种因素诱导的复杂病理过程，其主要机制涉及氧自由基产生、钙离子超载、能量代谢障碍、炎症反应、内皮细胞功能障碍及凋亡等多个环节。心脏梗死面积的大小是急性心肌梗死患者愈后生存的决定性因素，大量研究表明，在心肌再灌注早期进行一定干预，可有效地减小心脏梗死面积。益气复脉作为古方生脉散的现代制剂，在临床上广泛应用于心肌缺血性疾病。据文献报道，益气复脉可提高心脏功能，抑制核因子NF-κB的激活并显著降低肿瘤坏死因子、白细胞介素-6和白细胞介素-1β等炎症因子的活性，具有一定抗炎、抗氧化损伤的作用。然而，益气复脉是否可改善心肌缺血再灌注模型的有效性和合理的给药干预时间尚未阐明。

超声心动图(US)作为一种无创、实时、活体、动态研究小动物微小结构形态及功能评价的方法，为开展心血管疾病病理与治疗基础研究项目提供技术平台。本研究利用US测定心肌缺血再灌注损伤小鼠EF、FS，结果显示模型组小鼠心脏功能明显受损，益气复脉各时间点给药组EF、FS平均值均高于模型组，提示对心脏功能有一定改善作用，但各时间点给药组与模型组之间无显著性差异，这可能与单次给药或再灌注时间过短有关。本研究结果还显示，在不同时间点给予益气复脉都能有效降低模型小鼠心脏的梗死面积，与阳性药Ca2+通道阻断剂Verapamil组之间无显著性差异，益气复脉+10min组的效果略弱于其他组别。组织病理学检查表明模型组小鼠的心肌组织呈现严重的心肌变性，心肌纤维肿胀，坏死增加及炎性细胞的浸润，而益气复脉各时间点给药组可显著改善模型小鼠心肌组织损伤，心肌组织炎性细胞浸润、细胞水肿和坏死减少。益气复脉+10min组活性略差于其他组，这可能与补益方剂本身具有滋养、补益机体气血阴阳不足的作用，用于正常动物可能有滥补留邪之嫌有关，提示“虚则补之”更符合中医治则。

另一方面，血清CK和LDH活力是再灌注损伤的重要诊断指标。CK通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量代谢、肌肉收缩等有直接关系的重要激酶。在心肌梗死中减少ATP-CK代谢与改善心脏收缩功能有一定相关性。LDH活力的上升与心肌细胞坏死密切相关，其活力高低说明细胞膜完整性被破坏的程度大小。本研究结果显示，益气复脉各时间点给药组可显著降低模型小鼠心肌损伤，提示益气复脉可改善ATP代谢，保护心肌细胞，从而减少CK的释放。LDH活力测定显示，益气复脉－20min、益气复脉－30min组明显优于其他各组别，在缺血20min和30min时间点可更有效减少心肌细胞的坏死，从而减少LDH的释放。上述实验结果证实，益气复脉对小鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的改善作用，为该制剂临床防治心肌再灌注损伤提供实验依据。另据报道，益气复脉中的人参皂苷类化合物具有拮抗钙离子通道和抗自由基的作用，还可改善血流动力学参数，扩张冠脉血管，增加血流量，减少外周阻力，在不增加心率的情况下调节血压，不增加心脏氧消耗量的情况下增加心脏每搏输出量；益气复脉中的五味子具有抗氧化活性；益气复脉中的麦冬多糖和皂苷类成分有一定抗心肌缺血作用。提示上述组分对益气复脉改善心肌再灌注损伤的整体活性均有一定贡献，值得进一步

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