环状RNAACR通过调节Pink1FAM

环状RNA(circRNA)是一类共价闭合的单链非编码RNA，由RNA聚合酶II转录。迄今为止，一些研究表明circRNA在许多细胞过程中具有重要作用，且与各种疾病发展密切相关。其中，circRNA发挥功能的两种常见模式，可以作为miRNA和RNA绑定蛋白（RNAbindingprotien，RBP）的sponges。除此之外，circRNA还有其他重要的潜在功能，如可翻译产生蛋白、假基因的产生来源、作为潜在生物标志物。然而，circRNA在自噬中的作用仍不清楚，有待进一步研究。

自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞生物中的一种细胞自我吞噬的现象,在正常生理状态下,细胞自噬维持在很低的基线水平,用以清除衰老的细胞器及降解异常积聚的蛋白质,从而保持机体内环境的稳定。当细胞处于饥饿、生长因子缺乏或高能量需求状态时,自噬水平迅速上调。

越来越多的研究表明，自噬死亡是一个不同于细胞凋亡的重要过程。自噬已被证明在许多生理和病理过程中起着关键作用。自噬失调与扩张型心肌病、缺血性心脏病、心力衰竭等多种心脏疾病有关。虽然自噬的调控在心血管疾病中很重要，但对于自噬相关的心脏疾病和心力衰竭目前还没有有效的治疗方法。探索和揭示自噬调控的分子机制，将为心血管疾病的治疗提供潜在的介入策略。

研究内容

一ACR参与体内自噬的调节

为了研究circRNA在心脏自噬中的潜在作用，作者在I/R损伤诱导自噬的小鼠心脏中进行了circRNA微阵列分析(图1a)。找到了I/R损伤后明显下降circRNAACR(图1b,c)，提示ACR与心脏自噬的调节有关。并且用RNaseR酶切进一步证实了ACR的圆形性质,因为环状RNA的性质比较稳定，不易被核糖核酸内切酶分解，所以ACR在RNaseR酶作用下下降不明显。(图1d)。作者过表达了ACR,通过northernblotting分析，含有ACR的腺病毒导致ACR的过表达。在体内，ACR降低了I/R损伤时LC3-II水平的升高(图1e)。此外，ACR过表达减少了I/r诱导的心室组织广泛空泡化，电镜(EM)分析显示(图1f和图1g)。在I/R损伤后，ACR处理的小鼠心肌INF大小显著减小(图1h)。

二ACR抑制心肌细胞自噬和细胞死亡

接下来作者在细胞层面中研究ACR对自噬中的作用，作者研究了ACR在心肌细胞自噬中的作用。GFP-LC3斑点的积累是自噬体和自噬增加的指标。作者观察到，A/R损伤的LC3II是增加的,cirRNAACR是降低的。作者过表达ACR后绿色荧光蛋白所示LC3II减少(图2c)WB也显示LC3II在心肌细胞的表达减少(图2d)。EM分析显示ACR可以减少A/R诱导的心肌细胞自噬小泡(图2e)，也可以减弱A/R诱导的细胞死亡(图2f)。

三ACR调节Pink1的表达

为了进一步研究ACR的功能，作者通过转录组芯片寻找其下游靶点。发现在ACR敲低后，多种基因的表达发生了改变(图3a)。找到了变化明显并且与自噬有关的两个基因Irgm1和Pink1。(图3b)。过定量PCR(qPCR)分析了Irgm1和Pink1的表达，发现在敲低ACR的心肌细胞中，Pink1显著降低，但对Irgm1的表达影响不大(图3c-e)。相比之下过表达,ACR细胞显示,Pink1表达水平显著提升(图3f)Irgm1表达水平变化不大(图3gh)。这些结果表明,ACR能调节Pink1的表达,和Pink1可以作为一个潜在的下游目标参与ACR调节自噬的过程。

四ACR通过与DNMT3B结合抑制Pink1的DNA甲基化

那么ACR是如何调节Pink1的呢？，作者试图进一步了解ACR在Pink1表达中的调控作用。DNA甲基化已经被证明可以控制局部基因的表达。Pink1相关启动子处存在一个强的CpG岛，提示Pink1可能受到DNA甲基化的控制，ACR可能通过调节启动子甲基化来调节其表达。为了测试Pink1的转录是否能被DNA甲基化调控，作者使用甲基化抑制剂(5-Aza)处理心肌细胞。与预期的一样，5-Aza处理诱导了Pink1表达的增加。作者通过亚硫酸氢盐序列分析探究ACR是否通过启动子DNA甲基化调控Pink1表达。亚硫酸氢盐测序对CpG甲基化的分析表明，心肌细胞ACR敲低增加了Pink1启动子的甲基化程度(图4a)。ACR对Pink1启动子甲基化的调控促使我们推测ACR是否可以招募或关联DNA甲基转移酶(DNMTs)家族成员。为了测试ACR是否与DNMTs存在物理关联，作者使用抗维持酶Dnmt1和新生酶Dnmt3A或Dnmt3B的抗体进行RNA免疫沉淀(RIP)。观察到ACR在Dnmt3B-rna沉淀中富集，但未检索到Dnmt1和Dnmt3Arna，这表明ACR和Dnmt3B之间存在物理相互作用(图4b)。接下来，我们使用生物素化的ACR探针进行RNA下拉实验，发现ACR探针下拉了大量的Dnmt3B(图4c)。为了进一步探索了ACR抑制Pink1启动子甲基化的机制。RNA下调后westernblot分析显示，ACR敲低导致Dnmt3B结合显著降低(图4d)。ChIp-qPCR实验结果显示，ACR敲低增强了DNMT3B与Pink1启动子CpG区域的结合(图4e)，表明ACR阻滞了Dnmt3B与Pink1启动子的关系。此外，ACR的过表达抵消了Dnmt3B对PINK1表达的抑制作用(图4g)。此在A/R处理(图4h)或I/R损伤(图4i)情况下，观察到Dnmt3B和PINK1启动子之间的结合增加。总的来说，这些数据表明ACR在体内与Dnmt3B结合，从而阻止Dnmt3B介导的Pink1的DNA甲基化

五Pink1调节心肌细胞自噬

接下来，作者测试Pink1是否在自噬中发挥功能作用。Pink1的过表达(图5a)减少了a/r处理细胞中GFP-LC3-II的点状聚集(图5b)。在A/R处理后，Pink1过表达也减弱了自噬小泡(图5c)。Pink1降低了A/r处理细胞的LC3-II水平(图5d，上图)和细胞死亡(图5d，下图)。这些结果表明Pink1介导心肌细胞自噬和细胞死亡。

六Pink1在体内调节自噬信号

为了在体内证实这一现象，作者通过构建在-肌球蛋白重链启动子控制下的Pink1序列，生成了具有心脏特异性表达Pink1的转基因小鼠(图6a)。这些小鼠在生理条件下正常发育至成年，其表型和心功能均无明显变化。转基因小鼠成年心脏中稳定表达Pink1，其中Pink1的表达量大约是WT心脏的2~5倍。这些小鼠在I/R损伤后，Pink1的水平与WT组相比有所增加(图6b)。通过心室组织EM分析发现，Pink1转基因小鼠自噬减少(图6c、d)。在Pink1转基因小鼠中，I/R损伤引起的心肌INF增加明显减少(图6e)，心肌功能明显改善(图6f)。这些数据提示Pink1参与调节心脏自噬信号和细胞死亡。

七Pink1靶向并磷酸化FAM65B

为了研究Pink1调控自噬的潜在机制，确定Pink1的下游靶点。免疫共沉淀结果显示，Pink1可以与FAM65B结合(图7a)。通过MS对FAM65B的蛋白序列进行筛选，作者发现S46被磷酸化了(图7b)。S46在小鼠、大鼠和人中均存在(图7c)。为了证实S46位点的磷酸化位点，作者提高了针对S46、T和S位点的FAM65B磷酸化的抗体，并以后者作为对照。只有S46被磷酸化(图7d)。作者获得了两个突变体，一个将S46转化为A46，另一个将S44转化为A44，作为对照。通过使用转录和翻译耦合的兔，作者发现S46A突变体不能被磷酸化(图7e)。Pink1的敲低(图7f)导致S46磷酸化水平下降，而FAM65B的总表达水平保持不变(图7g)。作者还生成了Pink1激酶死亡突变体研究Pink1的激酶活性[21,47]。Pink1的激酶死亡突变导致S46磷酸化水平降低(图7h)。这些数据表明，FAM65B可以在S46位点被Pink1磷酸化

八ACR通过Pink1和FAM65B发挥自噬作用

然后，作者研究了FAM65B磷酸化是否在自噬中起作用。A/R处理后，磷酸化的FAM65B水平下降，而不是FAM65B总水平下降(图8a)过表达的FAM65B突变体将残基S46转化为丙氨酸(FAM65B-46a)，相比其在WT过表达FAM65B(FAM65B-WT)细胞中的磷酸化水平，并没有增加FAM65B磷酸化水平(图8b)。这些结果表明，磷酸化的丝氨酸46可能是FAM65B活性的原因。此外，FAM65B-wt可显著减弱A/r诱导的心肌细胞自噬(图8c和图8d)和细胞死亡(图8e)，而FAM65B-46A不能。接下来，作者测试磷酸化的FAM65B是否参与acr介导的自噬调控。检测了ACR对FAM65B磷酸化的影响。敲除ACR显著降低了FAM65B的磷酸化水平(图8f。过表达ACR增加了磷酸化的FAM65B的水平(图8g)，而Pink1的敲除则减弱了ACR诱导的磷酸化的FAM65B的增加(图8h)。此外，过表达ACR抑制了A/r诱导的FAM65B磷酸化水平的降低和自噬水平的升高，而Pink1的沉默抑制了ACR诱导的FAM65B磷酸化水平的升高(图8i)和自噬水平的降低(图8j)。这些数据表明ACR通过pink1依赖的FAM65B磷酸化作用来抑制自噬和细胞死亡。

总结

在这里，作者报道了一种circRNAACR，通过靶向pink1介导的FAM65B磷酸化来抑制自噬和心肌梗死。ACR可降低心肌细胞自噬和细胞死亡。此外，ACR保护心脏不受缺血/再灌注(I/R)损伤，并减少心肌梗死面积。作者确定Pink1作为ACR靶点，介导ACR在心肌细胞自噬中的作用。ACR通过直接与Dnmt3B结合，阻断Dnmt3B介导的Pink1启动子的DNA甲基化来激活Pink1表达。Pink1抑制自噬，转基因Pink1小鼠心肌梗死面积减小。进一步，发现FAM65B是Pink1的下游靶点，Pink1磷酸化FAM65B的丝氨酸46。磷酸化的FAM65B可抑制心脏自噬和细胞死亡。发现揭示了circRNA在调节自噬中的新作用，而ACR-Pink1-FAM65B轴作为心脏自噬的调节因子，将成为治疗心血管疾病的潜在治疗靶点。

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